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如何运用液相色谱仪HPLC检测发酵豆制品中10种生物胺的含量

小编 / 2022-06-08 13:11

  采用高效液相色谱法(HPLC)测定了发酵豆制品中10种生物胺的含量,并测定了部分发酵豆腐制品中生物胺的含量。


  一、材料与仪器

  1、试剂与样品

  腐胺,尸胺,精胺,亚精胺,色胺,2-苯乙胺,组胺,酪胺,胍丁胺,苯甲酰氯,庚胺的纯度均在97%以上。

  5- 羟基色胺, 纯度 98%;

  乙腈,色谱级;

  纯净水;

  其它试剂均为分析纯级。

  臭豆腐干样品;白方、红方、青方腐乳。


  2、仪器

  高效液相色谱仪配紫外检测器;

  高速电动匀浆器;

  大容量离心机。


  二、试验方法

  1、标准溶液的配制

  用0.1mol/L盐酸溶液制备了10种生物胺贮存液(腐胺、尸胺、精胺、色胺、2-苯乙胺、组胺、5-羟色胺、酪胺和胍丁胺)。将10种生物胺贮存液(腐胺、身体碱、精胺、色胺、2-苯乙胺、组胺、5-羟色胺、酪胺、胍丁胺)混合成质量浓度为10 0μg/mL的混合标准溶液。

  用0.1 mol/L盐酸溶液将1 mg/ml内标庚胺储备液稀释至质量浓度为100 ug/ml的内标工作液中。将所有溶液储存在4℃冰箱中。


  2、标准曲线的制作

  将100μg/ml生物胺混合标准品工作液用0.1 mol/L盐酸溶液稀释至80、50、20、10、5、1、0.5和0.1μg/ml。

  具体的衍生方法为:不同浓度的稀释剂2mL,10 0μL 10 0μg/mL内标工作液,1mL 2 mol/L NaOH,10μL苯甲酰氯,然后旋涡振荡30 s,反应30℃40 min,反应20 min,旋涡振荡30 s。

  加入2ml饱和nacl溶液终止反应。然后加入3ml乙醚,1000g离心10分钟。除去乙醚层并重复提取过程。将乙醚层并入规格为10 ml的离心管中。干燥氮气,然后溶解在1 ml乙腈(色谱级)中,并用0.45 um脱氟膜过滤。每个样本并行3次。样品在黑暗中保存在4摄氏度的冰箱中,并在24小时内完成检测。


  3、样品的前处理

  样品在灰泥中均匀打磨。5.0g置于5 0ml离心管中,内标为2 5 0μL(10 0 0μg/mL庚胺储备液),然后加入0.4 mol/L高氯酸溶液分散,均相1 min,振荡萃取5 min,静止5 min,然后离心35 min。将培养基移至50 mL瓶中,用20 mL高氯酸溶液再提取,与相应体积瓶合并,用0.4 mol/L高氯酸溶液固定体积,2mL按标准品衍生法处理。在本实验中,每个样品的处理重复三次。


  4、色谱条件

  色谱柱:ODS-3 250 mm×4.6 mm , 5μm ;

  柱温: 30 ℃ ;

  流动相A:0.01mol/L醋酸铵溶液;

  流动相 B :乙腈;

  进样量: 20 μL ;

  紫外检测波长: 254 nm ;

  色谱工作站。


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