16.2.1.7 分析条件的选择

(1)提取净化

牛奶样品为高蛋白液态样品，参考文献试验了不同的提取剂，乙腈甲醇能很好地沉淀蛋白，但对罗硝唑的提取率只有60%左右且浓缩时比较费时。乙酸乙酯能很好地提取出五种目标分析物但是不能沉淀蛋白，提取溶液很容易乳化。5g样品先加入5mL乙腈来沉淀蛋白，再加入20mL乙酸乙酯来提取分析物，便解决了以上单一有机溶剂提取时遇到的问题。所以方法提取溶液选择5mL乙腈+20乙酸乙酯提取两次。

硝基咪唑类药物为两性化合物，在弱酸性溶液中呈分子状态。根据其性质，在添加水平5ug/kg，试验了不同类型的固相萃取柱，包括C18柱(反相萃取柱)，硅胶、氧化铝柱(正相萃取柱)，SCX柱(强阴离子交换柱)。结果表明，用C18柱净化效果较差，基质影响比较严重；用硅胶柱和氧化铝柱处理的净化效果也不好且五种药物的绝对回收率小于60%；而用SCX柱不仅可以消除干扰而且回收率在90%以上。这是因为强阳离子交换柱上的磺酸基能有效的吸附质子化的硝基咪唑类药物，即使是极性强的有机溶剂亦不能洗脱。这样就可以用丙酮、甲醇淋洗掉大部分干扰成分，然后用5%氨水-乙腈置换洗脱目标分析物。由洗脱曲线(见图16-3)可知前2mL洗脱液未将分析物洗脱下来，而后4mL洗脱液可将5种药物从固相萃取柱.上完全洗脱下来。同时硝基咪唑类药物热不稳定，在氮吹一步应注意不能将其完全吹干，若完全吹F就会降低方法的回收率，尤其是二甲硝咪唑吹干后会损失30%左右。

图16-3 硝基咪唑类药物在SCX柱上的累积洗脱曲线

(2)色谱条件的建立

实验采用了0.1%乙酸-乙腈做流动相，采用时间梯度洗脱，在150mm×2.1mm(i.d.)，填料颗粒直径4.6μm的苯基柱分离待测组分，分析物在最大程度上得到了分离，且峰对称尖锐，加之质谱的高选择性，通过MRM色谱图能够较好的定性定量5种分析物，无内源干扰物影响组分的测定。

(3)质谱条件的建立

用蠕动泵以10μL/min注入1μg/mL的混合标准溶液来确定各化合物的最佳质谱条件，包括选择特征离子对，优化电喷雾电压、鞘气、辅助气、碰撞能量等质谱分析条件。分析物的混标液和内标混合液进入ESI电离源，在正、负离子扫描方式下分别对分析物进行-级全扫描质谱分析，得到分子离子峰。5种分析物及3种内标均在正模式下有较高的响应，负模式下信号值很低。然后对各分子离子峰进行二级质谱分析(多反应监测MRM扫描)，得到碎片离子信息，各化合物的[M+H]离子碎裂机理可用图16-4表示。

图16-4 硝基咪唑类药物分子离子MRM模式下的裂解示意图

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