12.2.5.6测定

(1)液相色谱测定条件

色谱柱： Kromasil 100-5C18，5 μm，150 mm×4.6 mm(内径)或相当者；流动相： 0.01 mol/L草酸溶液-乙腈～甲醇(77+18+5，v/v/v)； 流速： 1.0 mL/min；柱温： 40℃； 检测波长： 350 nm；进样量：60 μL。

(2)液相色谱测定

将混合标准工作溶液分别进样，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线，用标准工作曲线对样品进行定量，样品溶液中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素的响应值均应在仪器测定的线性范围内。在上述色谱条件下，土霉素、四环素、金霉素、强力霉素的参考保留时间分别为3.09 min、3.73 min、8.27 min和12.53 min。土霉素、四环素、金霉素、强力霉素标准物质液相色谱图见图12-11。

图12-11 土霉素、四环素、金霉素、强力霉素标准物质液相色谱图

12.2.5.7 分析条件的选择

(1)提取条件的选择

四环素类抗生素分子含有若干亲水的羟基，易溶于水和较低级的伯醇类，在中性和酸性溶液中较稳定。在pH 3～8的范围内离子化，在pH3左右以阳离子形式存在，在pH 7.5以上时以阴离子形式存在。可与二价、三价金属离子阳离子螯合。

牛奶中含有丰富的蛋白质和钙，影响四环素抗生素的提取。采用了20%三氯乙酸、硫酸锌-亚铁氢化钾体系、乙腈等作为蛋白沉淀剂，虽然蛋白沉淀效果较好，但回收率均较低。用pH 4.0的Mcllvaine-Na2EDTA缓冲液提取，并在较低温度下离心，可以起到沉淀蛋白的作用，并掩蔽二价阳离子Ca2+和Mg2+的干扰，可以获得较为满意的回收率，因此选用pH 4.0的Mcllvaine-Na2EDTA缓冲液为提取液。

(2)净化条件的优化

在实验中，对比了WCX、Oasis HLB单-固相萃取柱和Oasis HLB固相萃取柱加羧酸型阳离子交换柱双柱合用的效果。实验发现，WCX柱净化效果不好且回收率低。单用Oasis HLB固相萃取柱净化，也有较大的干扰峰存在，如图12-12所示；而采用Oasis HLB和羧酸型阳离子交换柱双柱净化，净化效果好，在待测物出峰处无干扰峰，见图12-13。 在对HLB柱的洗脱条件上对比了乙酸乙酯、甲醇以及二者一定比例的溶液，见表12-28。 发现随着甲醇比例的提高，回收率会增加，说明甲醇的洗脱效果较好，当甲醇比例达到50%时和纯甲醇的洗脱效果相差不大，但是考虑到HLB的上样液及淋洗液为水溶液，洗脱溶液有乙酸乙酯存在时，需要对柱体抽干很长时间，洗脱液才能顺利的滴下，所以本方法选择甲醇为HLB洗脱剂。通过试验，用5 mL即可达到完全洗脱的目的。

图12-12 牛奶空白样 品经HLB固相萃取柱净化后色谱图

图 12-13 牛奶空白样品经HLB和Carboxylic Acid双固相萃取柱净化后色谱图

表12-28 不同溶剂对HLB柱的洗脱效果

(3)色谱条件的优化

使用Kromasil 100-5 C18 (150 mm×4.6 mm)液相色谱柱对土霉素、四环素、金霉素、强力霉素的进行分析，采用0.01 mol/L草酸溶液+乙腈+甲醇溶液(v/v/v)作为流动相，用70+20+10，75+20+5，80+15+5，77+18+5 等不同比例的溶液进行分离，发现以77+18+5比例的流动相可以使4种四环素族抗生素达到很好的分离，并且可以在较短时间内出峰。因此选用此比例的溶液作为流动相。