5.2.7.6测定

(1)液相色谱条件

色谱柱：ZORBAXSB-C18，3.5μm，150mm×2.1mm(内径)或相当者；流动相组成、流速及梯度程序见表5-35；柱温：30℃；进样量：20μL。

(2)质谱条件

离子源：电喷雾离子源；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测；电喷雾电压：5500V；雾化气压力：0.055MPa；气帘气压力：0.079MPa；辅助气流速：6L/min；离子源温度：400℃；定性离子对、定量离子对和去簇电压(DP)、碰撞气能量(CE)见表5-36。

(3)定性测定

选择每种待测物质的一个母离子，两个以上子离子，在相同实验条件下，样品中待测物质的保留时间，与基质标准溶液中对应物质的保留时间偏差在±2.5%之内；样品谱图中各定性离子相对丰度与浓度接近的基质标准溶液的谱图中离子相对丰度相比，偏差不超过表1-5规定的范围，则可判定为样品中存在对应的待测物。

(4)定量测定

用基质标准混合工作溶液分别进样，以标准工作溶液浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线。用标准工作曲线对样品进行定量，样品溶液中四种头孢菌素的响应值均应在仪器测定的线性范围内。在上述色谱条件下，4种头孢菌素标准物质的多反应监测(MRM)色谱图见图5-6。

5.2.7.7分析条件的选择

(1)固相萃取柱的选择

在本方法的研究中，用OasisHLB固相萃取柱、BUNDELUT C18固相萃取柱、ENVI-18固相萃取柱、Octadecyl C18固相萃取柱、LiChrolutEN固相萃取柱和Sep-Pak C18固相萃取柱共六种固相萃取柱对四种头孢菌素的提取效率和净化效果进行了比较。实验发现，Sep-PakC18固相萃取柱回收率低(只有50%～60%)，且净化效果也不理想，Sep-Pak C18固相萃取柱不适合本方法。ENVI-18固相萃取柱、LiChrolutEN固相萃取柱和Octadecyl C18固相萃取柱的回收率均好，但样品溶液过柱速度较慢，样品预处理时间长，有的还存在着不同批次之间回收率的不稳定。OasisHLB固相萃取柱、BUNDELUT C18固相萃取柱对四种头孢菌素的提取效率和净化效果较好，四种头孢菌素回收率的重现性也优于其他固相萃取柱。而OasisHLB固相萃取柱样品溶液过柱速度优于BUNDELUTC18固相萃取柱，因此，本方法选用OasisHLB固相萃取柱作为样品净化柱。

(2)提取溶液的选择

在本方法的研究中，根据牛奶样品的特点和被测物的性质，确定磷酸二氢钠缓冲溶液作为提取液。通过回收率实验，比较了提取液中磷酸二氢钠缓冲溶液浓度和pH对四种头孢菌素回收率的影响，结果见表5-48和表5-49。

表5-48 提取液浓度对四种头孢菌素回收率(%)的影响

表5-49 提取液pH对六种头孢菌素回收率(%)的影响

从表5-48和表5-49可以看出，当提取液中磷酸二氢钠浓度为0.10mol/L，pH为8.5时，四种头孢菌素回收率最佳，因此，本方法使用pH8.5，0.10mol/L磷酸二氢钠溶液作为提取液。

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