22.2.4 液相色谱条件

色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18柱(2.1mm×100mm，3.5um)，流动相A为0.1%甲酸水(含5mmol/L乙酸铵)，流动相B为乙腈；梯度洗脱，程序见表22-4；流速为0.3mL/min；柱温：40℃；进样量：10μL。

表22-4 梯度洗脱程序表：

22.2.5 质谱条件

电喷雾电离正离子模式(ESI+)；毛细管电压：4000V；脱溶剂气温度：225℃，脱溶剂气流量10L/min。鞘气温度：325℃，鞘流气流速11L/min。锥孔电压和碎裂电压分别为65V和400V。参比离子为m/z 121.0509和m/z 922.0098，用于正离子模式下的实时校正。数据采集采用棒状图数据采集模式，扫描范围为50～1700m/z，扫描速率为3spectra/s。数据采集与处理通过Agilent MassHunter Workstation Sofware(version B.04.00)，包括数据采集，定性分析，定量分析软件。

22.2.6 兽药种类的确定

由于兽药种类繁多，此次研究针对性地选择了常用兽药品种，建立精确质量数据库，兽药种类包括四环素类(5种)、喹诺酮类(18种)、磺胺类(23种)、大环内酯类(9种)、苯并咪唑类(16种)、硝基咪唑类(6种)、β-受体激动剂类(15种)、激素类(14种)、镇静剂类(6种)、共计112种。涉及兽药用途包括抗生素、合成抗菌药、抗寄生虫药、激素等。

22.2.7数据库的构建

(1)MS数据的采集

向仪器注入浓度为1000μg/L的标准溶液，由LC-Q-TOF-MS在MS模式下进行测定，在“Find by Formula”功能中对实验数据进行处理，当目标化合物得分超过90，精确质量偏差低于5ppm时，认为化合物被识别。并记录下该峰在色谱分离条件下的保留时间，母离子的精确分子量以及离子化形式([M+H]+，[M+NH4]+和[M+Na]+)。

将化合物名称，CAS号，分子式，精确分子量，保留时间等信息，输入PCDL软件。如恩诺沙星的英文名称Enrofloxacin，CAS号93106-60-6，分子式C19H22FN3O3和精确质量数359.1645(见图22-6)。此外，通过数据处理确定了环丙沙星以[M+H]+峰为主，精确质量数为360.1718，因此，选定其为母离子，进行碎片离子信息的采集。

(2)MS/MS数据的采集

对于碎片离子谱库，如图22-7所示，在Targeted MS/MS采集界面输入兽药的母离子，保留时间和不同的碰撞能量，对其进行数据采集。数据先由“Find by Formula”进行检索，处理结果得分超过90，精确质量偏差低于5ppm；然后，采用“Find by targeted MS/MSn对数据进行处理，并导出CEF文件；最后，将CEF文件导入PCDL软件中，与对应的兽药信息相对应并保存。碎片离子谱库中每种兽药含有不同碰撞能量下的碎片离子信息。仍以恩诺沙星为例，输入其保留时间(8.5min)和母离子(m/z 360.1718)，采集其在不同碰撞能量下的碎片离子信息(见图22-8)，将其导入PCDL软件中。

图22-6 兽药数据库信息录入示意图

图22-7 碎片离子采集流程图


图22-8 不同碰撞能量下恩诺沙星碎片离子质谱图

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