(3)高效液相色谱法(high performance liquid chromatography，HPLC)

AVMs属于低极性化合物，利用反相-高效液相色谱(RP-HPLC)能获得较好的选择性。在AVMs残留分析中采用HPLC的方法报道较多，主要利用紫外检测器(UVD)、二极管阵列检测器(PDADAD)和荧光检测器(FLD)测定。

1)紫外检测器(UVD)

AVMs的共轭二烯结构在240～250nm处有强烈的紫外吸收，利用此特点，可建立紫外检测法，但在此光谱区域存在着皮质激素、维生素、脂类、核酸等众多内源性物质，会严重干扰检测。另外，AVMs在体内的最小有效浓度很低，如IVM在血浆中的最小有效浓度为0.5～1.0ng/mL，而在报道的HPLC-UVD方法中，灵敏度-般很难低于2ug/kg，难以满足分析要求。因此，采用UVD测定的方法并不多。

曹红等建立了HPLC-UVD法测定绵羊血浆中AVM的残留量。样品经乙酸乙酯提取后直接进HPLC测定。分离色谱柱为SHIMPAVKCLC-ODS柱，乙腈-含0.1%磷酸的磷酸二氢钾缓冲液(65+35，v/v)为流动相，流速1.0mL/min，检测波长245nm。该方法LOD为4ng/mL。Massarollo等报道了采用HPLC-UVD检测蜂蜜中AVM的残留分析方法。样品经LLE提取，SPE净化后，进RP-HPLC测定。以乙腈-甲醇-水为流动相，245nm检测。方法LOD和LOQ分别为0.002mg/kg和0.007mg/kg，回收率在73.4%～97.45%之间，RSD为0.91%～13.7%。Li等建立了猪肝中IVM的HPLCUVD测定方法。样品用甲醇提取，经IAC柱净化后进RP-HPLC检测，UVD在245nm下定量。方法LOD为2ug/kg，回收率在85%～102%之间，CV为6%～12%。Garcia-Mayor等报道了采用HPLC检测羊奶中IVM的残留分析方法。样品经MSPD技术处理后，进HPLC检测。色谱柱为Hypersil ODS柱(5um，250mm×4.6mm)，柱温60℃，25mmol/L KH2PO4(pH7)和乙腈为流动相，梯度洗脱，流速1.2mL/min，在245nm检测。该方法回收率为74%～97%，RSD在1.6%～9.0%之间。

2)二极管阵列检测器(PDA/DAD)

二极管阵列检测器(PDADAD)能实现对流出的色谱峰进行瞬间的全光谱扫描，同时得到色谱峰保留值、纯度和吸收光谱方面的信息。由于AVMs残留的确证方法一般比较复杂，当样品中药物残留水平较高时，PDADAD可以成为一种选择。通过对峰保留时间、吸收光谱形状与标准品的相似性，做出初步确证。Campillo等报道了检测奶中AVM、IVM、DOR、EPR和MOX的HPLC分析方法。样品经DLLME技术提取后，用HPLC-DAD检测，基质添加标准曲线定量，方法LOQ在1.0～4.7ng/g之间。

3)荧光检测器(FLD)

由于AVMs本身没有对称共轭结构，不能直接用FLD检测，只有经衍生化后，生成具有对称共轭的苯环结构才能发射荧光，故选择适宜的荧光衍生化试剂及反应条件显得非常重要。AVMs的荧光衍生一般遵循酰化、脱水然后成芳香环的机制(图21-1)，但荧光衍生物存在不稳定性的问题尚有待解决。FLD使检测的选择性和灵敏度显著提高，灵敏度较UVD约低1～2个数量级，可满足AVMs残留分析的要求。

图21-1 AVM的荧光衍生机制

Tolan等建立了血浆中IVM的分析方法。干燥后的提取物使用吡啶做催化剂，以醋酸酐为脱水剂，在105～110℃反应22～24h，荧光衍生反应产物经硅胶柱净化后，用RP-HPLC-FLD测定。激发波长和发射波长分别为364nm和480nm，方法的LOD为0.5μg/kg，RSD小于8%。Tway等报道了牛羊肝脏、脂肪和肌肉组织中IVM的HPLC-FLD测定方法。提取物在90℃温度下，用强亲核催化剂(N-甲基咪唑)和溶剂DMF衍生化反应1h，衍生产物进HPLC分析。方法回收率为83%，LOD可达1～2μg/kg。Norlander等检测猪肝脏中的IVM，采用类似的衍生化方法和FLD检测条件，方法平均回收率为87%，LOD为0.5～1μg/kg。De Montigny等采用强酰化剂三氟醋酸酐(TFAA)代替醋酸酐，以乙腈做溶剂，反应条件和操作步骤简单快速，不需要进一步的净化步骤。将动物血浆提取物中的溶剂吹干，加入100μL TFAA-乙腈(1+2，v/v)溶解残留物，再加入150uL N-甲基咪唑-乙腈(1+1，v/v)后，立即密闭(产生大量白雾并放热)，待白雾消失后，反应溶液可直接HPLC-FLD测定。该方法IVM的LOD可达到20pg/mL，同时衍生副产物减少。Rabel等用激光诱导荧光检测器(LIFD)测定血浆中IVM残留。窄径HPLC梯度洗脱与传统的荧光检测对血浆中IVM的LOQ为0.01ng/mL左右，而等度色谱条件与LIFD结合也能够达到0.01ng/mL的灵敏度。同时，自动衍生化进样操作可以减少手动操作，并消除潜在分析物/内标物的降解。

Payne等采用HPLC-FLD测定牛组织中的EPR。由于AVMs的荧光衍生试剂不太稳定，在2h内将损失50%，作者开发了-种自动化的衍生化过程。在这一过程中，样品提取液重新在甲基咪唑-乙腈溶液中再生，然后转移至进样瓶中供HPLC系统分析。在进样前利用自动进样器的混合功能，再往进样瓶中加入适量TFAA充分混匀。该方法LOD为1ng/g，LOQ为2ng/g；回收率为87%～100%，CV小于13%。Flajs等在对奶和血浆中DOR残留分析时，将干燥浓缩的提取物在室温下加入100uL N-甲基咪唑的乙腈溶液(1+1，v/v)和150μL TFAA(1+2，v/v)进行衍生化，再进HPLC-FLD分析。色谱柱为Supelcosil LC-8-DB柱(150mm×4.6mm，5um)，流动相为乙腈-甲醇-水(470+470+60，v/v)，流速1.1mL/min，激发波长364nm，发射波长470nm。分析结果表明，奶中DOR的LOD为0.04ug/kg，CCa为0.1ug/kg，检测能力(CCβ)为0.13ug/kg。Sutra等报道了检测狗血浆中SEL的HPLC-FLD方法。提取物经自动SPE净化后，用TFAA和N-甲基咪唑衍生，进HPLC测定，激发波长355nm，发射波长465nm。该方法LOD为0.1ng/mL。

Rupp等测定大西洋鲑鱼肌肉组织中的IVM和DOR，提取物用C8和硅胶柱净化后，用TFAA和N-甲基咪唑脱水处理，衍生形成荧光产物，该产物随后用乙酸铵-甲醇溶液溶解转换形成稳定的醇形式，该反应在50～55℃下需要15min。再用HPLC-FLD检测，色谱柱为Hypersil C18柱，流动相为乙腈-水(90+10，v/v)，柱温65℃，激发波长272nm，发射波长465nm。IVM和DOR的回收率分别为75%～89%和73%～85%，RSD小于7%；LOD为0.25ppb。Knold等报道了采用乙腈提取，TFAA柱后衍生，AVM为内标，以HPLC-FLD法测定猪肝中的IVM和DOR。样品用乙腈提取，上清液浓缩至近干，加110uL 1-甲基咪唑溶解，室温反应2min后，进HPLC检测。色谱柱为HypersilODS柱，水-乙腈(6+94，v/v)为流动相，柱温30℃，梯度洗脱，激发波长365nm，发射波长470nm。添加浓度为15ug/kg时，IVM和DOR的回收率分别为75%和70%，LOD为0.8ug/kg，LOQ为1.6μg/kg。

Ali等采用HPLC-FLD测定牛肝脏中的AVM、IVM、DOR、EPR和MOX残留时，AVM、IVM、DOR和MOX的衍生化产率瞬间可达到峰值，而EPR的产率则需要7h才能达到峰值。加热到65℃，EPR反应速度快，90min时产率最高，其他药物的产率亦增加10%～15%。方法回收率大于70%，CV小于20%。侯晓林等采用HPLC分离，FLD检测，建立了SPE分析牛组织中EPR、AVM、DOR和IVM残留的方法。样品用乙腈提取，碱性氧化铝和C18柱净化，用乙酸酐和1-甲基咪唑的乙腈溶液作衍生化试剂，在96℃条件下，完全衍生化需要100min。4种药物的平均回收率为70.02%～88.75%，日内CV小于8.52%，日间CV小于7.13%。EPR、AVM、DOR和IVM的LOD为0.4～0.5μg/kg，LOQ为2ug/kg。Roudaut等报道了检测肝脏组织中AVM、IVM、DOR和MOX的HPLC方法。样品用乙腈提取，C18柱净化，TFAA衍生化后进HPLC-FLD检测，激发波长361nm，发射波长465nm。方法LOQ满足欧盟的MRLs要求，回收率在77.5%～90.8%之间，RSD为2.7%～7.7%。Hou等检测牛肝和牛肉中EPR、AVM、DOR和IVM残留。样品用乙腈提取，C18柱净化，衍生化反应后，用HPLC-FLD测定。牛肝中的回收率为70.31%～87.11%，牛肉为79.57%～93.65%，RSD分别小于17.84%和14.68%；方法LOD为0.5～1.0ng/g，LOQ为1～2ng/g。