16.2.3.7 分析条件的选择

(1)色谱分离条件研究

1)色谱柱的选择

本方法选择了Waters公司的Sunfire-dC18柱(φ4.6 mm×250 mm； 5 um)和资生堂公司的UG120(φ4.6mm×250mm；5um)和MG-II C18柱(中4.6 mm×250 mm； 5 um)等色谱柱进行了比较。前者Sunfire-dC18柱对于多数碱性化合物保留都比较合适，pH适用范围广，在相同的流动相设置条件下，Waters Sunfire-dC18柱(φ4.6 mm× 250 mm； 5 um)的保留时间、响应峰的尖锐程度(信噪比S/N)以及分离度相对更优异、适合。

2)流动相的选择与优化

LC-MS/MS实验的流动相一般是甲酸、乙酸水溶液以及乙酸铵(挥发性盐)或者低浓度的乙酸铵盐溶液、乙酸-乙酸铵离子对缓冲盐(需要时调节pH)等。对于多数正离子模式下的分析，按照实验工作和仪器工程师经验推荐，一般需要少量的酸[H]+离子，利于正离子化和[M+H]+准分子离子峰的生成电喷雾电离离子源(ESI和APCI)容易受到样品基质的影响。试验中发现，样品基质对离子化有比较大的抑制作用(气相色谱和气质色谱多表现为增强)，不同样品基质对目标化合物离子化的抑制情况存在显著差异。为消除样品基质效应，以空白样品提取液作为标准溶液的稀释溶液，可以使标准和样品溶液具有同样的离子化条件，从而消除或者大大降低样品基质效应的不一致影响。

(3)提取和净化条件的选择

本方法最后确定的提取过程中，称取约2.5～5.0g蜂产品样品(蜂王浆、蜂蜜称量5.0g±0.2g；冻干粉称量2.5g±0.2g)于50mL离心管中，分别添加氘代标示物HMMNI-D3、IPZ-OH-D3(100ng/mL)100μL，加入20mL乙酸铵(0.1mol/L)溶液充分涡旋提取1min。再加入20mL乙酸乙酯，经过涡旋、液液萃取，将乙酸乙酯层全部移入鸡心旋蒸瓶，重复上述操作，合并三次乙酸乙酯提取液于鸡心旋蒸瓶，在40℃以下浓缩近干，除去溶剂。

本方法最后确定的净化过程中，鸡心旋蒸瓶残渣用1mL四氯化碳和1mL甲酸水溶液(0.1%)溶解，充分涡旋1min。吸取上层水溶液，用微孔过滤膜(0.2μm)过滤，此为试验溶液。

(4)前处理选择和讨论

蜂王浆样品含有大量蛋白质的均匀胶体，要从蜂王浆中提取抗生素和目标化合物，必须破坏其胶体状态。文献中有的选择2%三氯乙酸和2%柠檬酸沉淀蛋白，经实验，沉淀蛋白质时间短，效果理想，但是沉淀后的上清液经乙酸乙酯提取后，由于有酸性溶液存在，乙酸乙酯溶液难浓缩干。还有的实验而在负离子电离模式下，低浓度的乙酸铵盐溶液能够起到参与增强和活化离子化过程作用(比如氯霉素的LC-MS/MS方法下的流动相为2mmol/L的乙酸铵和乙腈混合梯度)。当然，如果梯度选择不当或者不优化，造成峰形不是很好，峰尖不够尖锐，甚至保留时间有较大漂移，原因不详。采用0.1%的甲酸溶液作为流动相，峰形优异，响应较好，也非常稳定。

(2)质谱测定条件的研究

1)质谱测定条件的优化

首先采用1mg/L的目标化合物的标准溶液分别以流动注射的方式在正/负离子模式下分别进行ESI源或者APCI源的母离子全扫描。

大气压电离源(atmospheric pressure chemical ionisation，APCI)是由ESI(电喷雾电离源)派生出，用大气压下电晕放电产生反应离子，既而再与溶液中样品分子发生离子分子反应，从而产生样品的质子化分子([M+H]+)或加合离子。APCI在小分子分析中与ESI相比，是一种温和的电离方式；目前，国内虽然大部分LC质谱实验室配备了APCI，但是实际使用和开展的应用非常少。本次实验中，首先尝试使用ESI源摸索质谱条件，效果并不理想：总离子流较低，Q1全扫描特征母离子响应不明显；通过改变方式，将连续推注针阀PEEK管端与HPLC接色谱柱的PEEK管端以三通的连接方式共同导入所使用的APCI源LC入口，进行质谱条件实验：设定HPLC四元泵以200μL/min左右且适合硝基咪唑化合物液相等度分离的流动相比例运行，同时，配吸有Nitroimidazoles各主要分析物单标(浓度5～10ppm左右均可)的连续推注针阀仍按常规方式以5uL/min的速度工作。由于解决了单标药物溶液的持续供给(ESI方式不存在这个矛盾)，并通过提供适量且连续流动液，再辅助以150℃左右的雾化加热，使得APCI电离方式得到极至发挥。

经过试验确定：在APCI源正离子模式下硝基咪唑类的准分子离子峰响应信号更优越；以硝基咪唑类正离子模式下的准分子离子为母离子，对其子离子进行全扫描，初步选取丰度较强、干扰较小的两至三对子离子为定性离子。

2)样品基质效应的消除

电喷雾电离离子源(ESI和APCI)容易受到样品基质的影响。试验中发现，样品基质对离子化有比较大的抑制作用(气相色谱和气质色谱多表现为增强)，不同样品基质对目标化合物离子化的抑制情况存在显著差异。为消除样品基质效应，以空白样品提取液作为标准溶液的稀释溶液，可以使标准和样品溶液具有同样的离子化条件，从而消除或者大大降低样品基质效应的不一致影响。

(3)提取和净化条件的选择

本方法最后确定的提取过程中，称取约2.5～5.0g蜂产品样品(蜂王浆、蜂蜜称量5.0g±0.2g；冻干粉称量2.5g±0.2g)于50mL离心管中，分别添加氘代标示物HMMNI-D3、IPZ-OH-D3(100ng/mL)100μL，加入20mL乙酸铵(0.1mol/L)溶液充分涡旋提取1min。再加入20mL乙酸乙酯，经过涡旋、液液萃取，将乙酸乙酯层全部移入鸡心旋蒸瓶，重复上述操作，合并三次乙酸乙酯提取液于鸡心旋蒸瓶，在40℃以下浓缩近干，除去溶剂。

本方法最后确定的净化过程中，鸡心旋蒸瓶残渣用1mL四氯化碳和1mL甲酸水溶液(0.1%)溶解，充分涡旋1min。吸取上层水溶液，用微孔过滤膜(0.2μm)过滤，此为试验溶液。

(4)前处理选择和讨论

蜂王浆样品含有大量蛋白质的均匀胶体，要从蜂王浆中提取抗生素和目标化合物，必须破坏其胶体状态。文献中有的选择2%三氯乙酸和2%柠檬酸沉淀蛋白，经实验，沉淀蛋白质时间短，效果理想，但是沉淀后的上清液经乙酸乙酯提取后，由于有酸性溶液存在，乙酸乙酯溶液难浓缩干。还有的实验采用文献方法，选10%偏磷酸溶液沉淀蛋白质，但是这些处理手段效果都一般。

本实验前期的工作主要采用称取约5.0～10g±0.2g左右的蜂产品样品(包括蜂王浆、蜂蜜、冻干粉等)于250mL锥形瓶中，依次加入多种硝基咪唑类药物、氘代标示物HMMNI-D3、IPZ-OH-D3后，分别加入18mL、5～10mL、10mL的2mol/L氢氧化钠溶液、20mmol/L乙酸铵溶液、2mol/L盐酸溶液。

其中氢氧化钠溶液和乙酸铵溶液加入后需要及时对样品进行涡旋、溶解，样品进一步均匀化后用2mol/L盐酸进行pH调节。

随后将充分涡旋的样品均匀的平分到两个50mL的塑料离心管中，分别加入15mL乙腈、15mL乙酸乙酯。对样品进行涡旋、液液萃取。

每个独立样品需要收集平分到两个50mL的塑料离心管中的有机相提取液，旋涡混合仪充分混匀2min，放入高速冷冻离心机离心(时间10min，转速5000r/min)；吸取有机层；合并到一个鸡心旋蒸瓶中；并分别再次加入5mL乙腈、5mL乙酸乙酯；对样品进行涡旋、液液萃取后合并提取液。合并后的提取液，于旋转蒸发仪浓缩近干(可能会有2～4mL水相)，再次加入0.2mol/L的盐酸溶液15mL，充分混匀，备用供SPE柱净化。

用OASIS MCX C18 SPE柱净化(先用5mL水、5mL甲醇活化，上样后分别10mL水、10mL甲醇淋洗)，经10%氨水甲醇溶液5mL洗脱，收集至15mL离心管中，于氮吹仪氮吹挥至近干，加入1mL流动相，充分旋涡混合，经0.22μm滤膜过滤，供HPLC-MS/MS分析。

这一处理过程结果相对较为复杂繁琐，实验结果中替硝哒唑和洛硝唑回收率不理想，所以最后选择了加入20mL的0.1mol/L乙酸铵、乙酸乙酯，液液萃取，浓缩近干，除去溶剂后残渣用1mL四氯化碳和1mL甲酸水溶液(0.1%)溶解，充分涡旋1min，吸取上层水溶液进样的方案。

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