(5)免疫分析法(immunoassay，IA)

免疫分析技术是以抗原与抗体的特异性、可逆性结合反应为基础的分析方法。免疫反应涉及抗原和抗体之间高度互补的化学、静电、氢键、范德华力和疏水域的相互作用，因此具有高选择性和高灵敏的特点，非常适用于复杂基质中痕量组分的检测。

1)酶联免疫分析法(enzyme linked immunosorbent assays，ELISA)

OLQ没有合适的活性功能基团可直接连接到载体蛋白，须先将其羟基改造为羧基后才能与载体蛋白偶联。宋春美等采用琥珀酸酐和活化酯法两步合成OLQ完全抗原，将OLQ与琥珀酸酐在90℃反应1h，生成喹乙醇酯半琥珀酸，再进一步与N，N-二环己基碳二亚胺，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)室温搅拌反应8h，生成N-羟基琥珀酰亚胺琥珀酸喹乙醇酯，再反应生成完全抗原喹乙醇蛋白偶联物，路线见图15-4。宋春美等以此建立了间接竞争ELISA法测定OLQ，半数抑制浓度(IC50)为1.66ng/mL，猪肝、猪肉中的平均回收率分别为77.6%和79.68%，平均批内和批间CV小于15%。

图15-4 OLQ抗原合成路线

Cheng等制备了喹噁啉类药物抗体，并建立了相应间接竞争ELISA测定方法。首先合成2-丙烯酸-1，4-双氮-喹噁啉(2-acrylicacid-1，4-binitrogen quinoxaline)，再与NHS和环己基碳二亚胺盐酸盐(DCC)在吡啶中室温反应3h进行活化酯反应，产物与卵清白蛋白(OVA)或牛血清白蛋白(BSA)偶联，获得包被原或免疫原，免疫动物获得抗体。所得抗体与OLQ、CBX、MQX、QCT和MQCA的交叉反应率大于50%，并以此建立了间接竞争ELISA方法，检测猪肝中OLQ、CBX、MQX、QCT和MQCA。样品中加入0.2mol/L盐酸，加热60℃，维持1h，将药物水解释放，高速离心水解液，取上清液ELISA测定。方法回收率为80.14%～96.90%，日间CV为5.67%～13.82%，日内CV为6.22%～14.19%，LOD为0.03～0.79μg/kg。冀宝庆建立了测定OLQ和MQCA的ELISA方法。将MQCA分别与BSA、OVA交联，制备成免疫抗原和包被抗原。用免疫原免疫新西兰白兔制备抗血清，得到针对MQCA的多克隆抗体，效价达到了32000。通过ELISA优化，OLQ的IC50达到了151.89ng/mL，LOD为4.33ng/mL；MQCA的IC50达到了3.84ng/mL，LOD为0.25ng/mL。

Cheng等建立了检测MQCA的特异性间接竞争ELISA方法。MQCA与NHS和DCC采用活化酯法合成半抗原，再分别与BSA和OVA偶联，作为免疫原和包被原，免疫小鼠，筛选获得单克隆抗体。由此建立间接竞争ELISA分析方法，与OLQ、CBX、MQX、QCT、CYX和QCA无交叉反应。猪肝中MQCA的回收率为85.44%～100.02%，批内CV为6.649%～10.57%，批间CV为7.29%～10.88%，LOD为1.0μg/kg。袁宗辉等采用与上述MQCA相同的活化酯法合成QCA完全抗原，研制了QCA的ELISA检测方法及试剂盒。样品经偏磷酸水解处理释放QCA，水解上清液用MAX柱净化，间接竞争ELISA方法测定。组织中QCA的LOD为0.6μg/kg，回收率为60%～120%。张泽英等167将QCA与y-氨基丁酸(ABA)衍生成喹噁啉-2-甲酰胺丁酸(QCA-ABA)，再与BSA偶联作为免疫原(QCA-ABA-BSA)，将QCA与卵清白蛋白(OVA)偶联作为包被原(QCA-OVA)，建立了猪可食性组织中QCA的间接竞争ELISA检测方法。结果表明，最优的QCA-OVA包被抗原浓度为4μg/mL，抗体稀释倍数为1：3.2×104，最适检测范围为0.2～51.2ng/mL，LOD为0.6μg/kg，对猪肌肉和猪肝脏的添加回收率为47.4%～87.7%。

2)免疫荧光猝灭检测法(fluorescence quenching immunoassay，FQI)

冀宝庆利用OLQ代谢物MQCA抗体，建立基于抗体抗原反应和纳米DNA技术的荧光猝灭高灵敏检测方法。首先合成纳米磁性粒子和纳米金粒子，将DNA与纳米金粒子偶联，得到了纳米探针，代替传统的辣根过氧化物酶(HRP)与二抗偶联后，在流动注射系统中进行免疫反应。对纳米探针上的DNA进行变性，收集得到了单链DNA序列，再将这些单链DNA与另一种粒径更小的，且具有互补寡核苷酸序列的金纳米探针进行杂交信号放大，利用荧光猝灭进行检测。该方法大大改善了检测限，达到了7.52pg/mL，检测范围为8.5～60pg/mL。Chen等制备了MQCA特异性抗体，利用流动注射系统纳米技术和金纳米粒子的荧光猝灭效应，建立了对MQCA的免疫荧光猝灭检测的方法。方法的线性范围2.5amol/L～250fmol/L，LOQ为1.4 amol/L，CV小于15%，回收率在89%～108%之间。此方法快速、易于自动化，可对猪肉等实际样品进行检测。

3)胶体金免疫层析法(gold immunechromatographic assay， GICA)

霍如林等研制了胶体金免疫层析法试纸条，用于动物源食品中OLQ药物残留的快速检测。将已制备纯化过的OLQ多克隆抗体与胶体金结合产生的金标抗体喷涂在玻璃纤维垫上，并将包被抗原OLA-OVA和羊抗鼠二抗分别结合在硝酸纤维素膜上，组装成免疫层析快速检测试纸条，并检测试纸条的灵敏度、特异性、准确性和稳定性。将制备的试纸条用于检测猪肉和猪肝样品，结果表明该试纸条可以在10min内完成检测，肉眼观察的LOD为0.05ug/mL，与结构类似物CBX、MQX、QCA的反应交叉性小，该试纸条假阳性率小于5%，假阴性率为0，在干燥常温条件下保存6个月仍然有效。该研究小组还研究了胶体金免疫层析试纸条快速定量检测猪肝中OLQ残留的方法。利用胶体金免疫层析技术，制备了OLQ胶体金试纸条，检测了其特异性并建立了T/C比值法进行定量检测猪肝中OLQ的残留。制备的试纸条可以在15min内完成定性和定量检测，与CBX、MQX、QCA几乎无交叉反应。当肝中OLQ质量浓度在1～200ng/mL范围内，试纸条有较好的线性关系，LOD为6.83ng/mL，回收率在90.9%～105.0%之间。