(6)高效液相色谱法(high performance liquid chromatography， HPLC)

本类药物的吡唑酮结构具有紫外吸收特性，HPLC分析主要采用反相色谱分离，紫外检测器(ultraviolet detector，UVD)测定。

1)酸性药物

庞国芳等采用反相HPLC测定了动物肌肉中的保泰松。以0.05 mol/L乙酸铵溶液-甲醇-乙腈(53+35+12， v/v) 为流动相，流速0.8 mL/min， C18 色谱柱分离，柱温40℃，检测波长270 nm。猪肉、牛肉、鸡肉、羊肉的回收率在75%～105%之间，RSD在4.0%～10.0%之间，LOD为5 μg/kg。作者对流动相配比进行试验发现，减少甲醇比例，杂质峰的数量显著增加，逐渐出现较大的干扰峰，直至淹没样品峰；减少乙腈的比例，灵敏度会减小，与杂质峰的分离度降低，峰形和回收率又逐步降低，但与样液中的干扰物能完全分开。

Neto等采用HPLC-UVD测定血液中的保泰松和羟布宗。净化后的样品采用Chrospher RP-18 色谱柱分离，流动相为0.01 mol/L乙酸-甲醇(45+55， v/v)， 流速1 mL/min，检测波长为254 nm。方法回收率为83%～105%， CV为4.7%～7.8%，保泰松的LOD为0.5 μg/ml，羟布宗为1.0 μg/mL。Grippa等建立了同时测定马血液中保泰松、羟布宗等4种药物的HPLC方法。色谱分离选用C18色谱柱，流动相采用乙腈-水(含0.1%三氟乙酸和0.1%三乙胺)(51+49， v/v)，流速1 mL/min，检测波长254 nm。保泰松、羟布宗的回收率分别为51.5%±2.7%和 37.9%±0.9%， CV分别为5.5%～ 14.8%和2.7%～13.6%；保泰松LOD为0.5 μg/mL，羟布宗为1 μg/mL。Marti 等采用乙腈提取血浆中的保泰松，上清液直接进HPLC分析。色谱柱采用chrospher 60 RP (150 mm×4.6mm，5um)，流动相为0.01mol/L乙酸-甲醇(35+65，v/v)， 流速1mL/min，检测波长240nm。方法回收率为83%，LOD和LOQ分别为0.016ug/mL和0.029μg/mL。Taylor等采用 HPLC测定马血液中保泰松和羟布宗。色谱柱为Hypersil C18(100mm×4.6mm，5um)，流动相为甲醇-0.1%乙酸溶液(6+4，v/v)，流速1.5mL/min，检测波长240 nm。保泰松和羟布宗的回收率分别为53.5%～63.1%和43.3%～47.2%；CV分别为5.1%和4.0%，LOQ为10μg/mL。De Veau测定牛血浆中游离的保泰松，血浆经过分子滤过膜滤去分子量大于10000的杂质后，离心取上清，进HPLC测定。色谱柱为反相C18(250mm×4.6mm，5μm)，流动相为0.2mol/L磷酸钠缓冲液-甲醇(1+1，v/v)，流速1mL/min，检测波长264nm。方法回收率为91%～93%，CV为1%～4%，LOQ为2 μg/mL。Caturla等将血液提取液蒸干后，用甲醇复溶，反相色谱C18(250mm×4.6mm，5μm)分离，流动相采用pH3的0.02mol/L硫酸铵-乙腈(45+55，v/v)，流速为1mL/min，检测波长240nm。保泰松和羟布宗的LOQ均为0.05μg/mL，回收率大于90%。Marunaka等测定血液和尿液中的保泰松、羟布宗，样品用盐酸酸化后，萃取至苯-环已烷(1+1，v/v)溶液，萃取液吹干后复溶于甲醇，进HPLC测定。色谱柱为C8(30cm×4mm，10μm)，流动相为甲醇-0.01mol/L乙酸铵，梯度洗脱，流速2.0mL/min，检测波长254nm。保泰松、羟布宗和y-羟基保泰松的LOD均为0.05μg/mL，保泰松、羟布宗的回收率分别为96.7%±1.7%和93.1%±3.7%。

Haque等将 血浆直接注入HPLC系统测定保泰松和羟布宗。采用半通透表面色谱柱5PM-S5-100-C18 (15 cm×4.6 mm)分离，流动相为乙腈磷酸盐缓冲液(15+85，v/v)， 流速1 mL/min，检测波长270nm。该方法线性范围为0.5～20ug/mL，CV小于6%，保泰松和羟布宗的LOQ和LOD分别为0.5ug/mL和0.25μg/mL，分析时间小于13min。半通透性表面色谱柱可多次进血清样品，色谱柱含有两种作用机制的固定相，外层为多孔水溶性的聚氧乙烯共价结合在硅胶基质上，内层为脂溶性C18、C8、氰基和苯基。半通透性表面色谱柱流动相中有机溶剂含量应低于25%，pH为5.5～7.5，溶液中盐分含量应在0.05～0.1mol/L之间，以防样品中蛋白质沉淀。该方法非常简单，血清样品可直接进HPLC测定。

2)碱性药物

Katz等建立了测定血浆中安乃近4种代谢物的HPLC方法。样品用氢氧化钠溶液碱化后，用二氯甲烷提取，提取液蒸干，流动相复溶，HPLC测定。色谱柱为PBondapak C18 柱(300mm×3.9mm)，流动相为甲醇-0.01mol/L乙酸钠溶液(用盐酸调节pH3.0)(8+92，v/v)，流速1.6mL/min，检测波长257nm，用异丙基氨基安替比林为内标定量。FAA和AAA的校正回收率为96.0%～100%，MAA和AA为70.6%～87.8%，CV均低于6.7%；LOD均为0.1μg/mL。王章阳等建立了同时测定兔血浆中安乃近及其3种代谢物(FAA、AA和MAA)的HPLC方法。以2-萘-磺酸钠为内标，pH6.5的。甲醇-水-磷酸盐缓冲液(35+63+2，v/v)为流动相，采用ODS(15mm×6mm)分析柱分离，流速1.0mL/min，柱温35℃，检测波长260nm。FAA、AA和MAA平均回收率均接近100%，LOD均为0.15μg/mL。崔景斌等用HPLC测定血浆中的安乃近代谢物MAA。内标物为异丙氨基安替比林，色谱柱为YWG-C18柱(150mm×5mm)，流动相为pH5.5磷酸盐缓冲液-甲醇(68+32，v/v)，流速2mL/min，检测波长254nm。MAA的绝对回收率为82.5%，相对回收率为99%，CV小于3.66%，检测LOQ为0.05μg/mL。

沈金灿等建立了牛和猪肌肉中安乃近代谢物FAA、AA和MAA的HPLC测定方法。采用Inertsil ODS3色谱柱分离，水和甲醇为流动相，梯度洗脱，流速1mL/min，检测波长265nm。FAA的回收率为81.3%～92.5%，AA的回收率为82.0%～96.0%，MAA的回收率为80.4%～90.6%；RSD均在7%以内；LOQ均为50.0μg/kg。研究发现，流动相pH低于7.0时，随着pH的降低，各组分在反相色谱柱上的保留降低。虽然各组分分离度并没有明显的降低，但由于保留时间的缩短容易引起目标组分与干扰组分共洗脱，从而影响目标物的测定。同时，在相同的梯度条件下，用甲醇时的保留时间比用乙腈的保留时间长，这使得FAA能够与干扰组分实现良好的分离。另外，在中性条件下，不同的水相流动相(20mmol/L醋酸铵溶液、20mmo/L磷酸盐溶液和纯水)对目标物的分离没有显著的影响，但采用缓冲液体系进行梯度洗脱时，基线会随着含水量的变化产生较大的波动。我国国家标准GB/T20747-200651也采用InertsilODS3色谱柱分离，以水-甲醇为流动相，梯度洗脱，流速1mL/min，265nm波长处测定FAA、MAA和AA。方法LOD在12.5～20ug/kg之间，定量范围为50～400ug/kg，回收率为80%～96%。

MikatimA等建立了测定尿液中安替比林及其代谢物的HPLC方法。尿液酶解后，用乙酸乙酯提取，提取液蒸干后用流动相复溶，进HPLC测定。色谱柱为反相C18柱(30cm×3.9mm)，流动相为含7.5%乙腈的0.1mol/L乙酸钠溶液(用乙酸调节pH6.6)，流速3.5mL/min，柱温35℃，检测波长254nm。安替比林、NORA、OHA、HMA的回收率在97%～105%之间，CV小于5%，LOQ低于3μg/mL。

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