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液相色谱-紫外检测法测定蜂蜜中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素残留量

[db:作者] / 2022-12-19 00:00

12.2.2.1 适用范围

  

蜂蜜中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素残留量的测定。方法检出限:土霉素、四环素、金霉素、强力霉素均为0.010mg/kg。

  

12.2.2.2 方法原理

  

蜂蜜试样中四环素族抗生素残留用0.1mol/L Na2EDTA-Mcllvaine(pH=4.0±0.05)缓冲溶液提取,经离心后,上清液用OasisHLB或相当的固相萃取柱和阴离子交换柱净化,紫外检测器高效液相色谱仪测定,外标法定量。

  

12.2.2.3 试剂和材料

  

甲醇、乙腈:一级色谱纯;磷酸氢二钠(Na2HPO4·2H2O):优级纯;乙酸乙酯:分析纯,重蒸馏;柠檬酸(C6H8O7·H2O)、乙二胺四乙酸二钠(Na2EDTA·2H2O)、草酸:分析纯。

  

磷酸氢二钠溶液:0.2mol/L。称取28.41g磷酸氢二钠,用水溶解,定容至1000mL;柠檬酸溶液:0.1mol/L。称取21.01g柠檬酸,用水溶解,定容至1000mL;Mcllvaine缓冲溶液:将1000mL0.1mol/L柠檬酸溶液与625mL 0.1mol/L磷酸氢二钠溶液混合,必要时用NaOH或HCl调pH=4.0±0.05;4.11 Na2EDTA-Mcllvaine缓冲溶液:0.1mol/L。称取60.5g乙二胺四乙酸二钠放入1625mL Mcllvaine缓冲溶液中,使其溶解,摇匀;甲醇+水(1+19,v/v):量取5mL甲醇与95mL水混合。

  

土霉素、四环素、金霉素、强力霉素标准物质:纯度≥95%。

  

土霉素、四环素、金霉素、强力霉素标准溶液:0.1mg/mL。准确称取适量的土霉素、四环素、金霉素、强力霉素标准物质,分别用甲醇配成0.1mg/mL的标准储备液。储备液贮存在-18℃。根据需要用流动相逐级稀释成适当浓度的混合标准工作溶液,混合标准工作溶液在4℃保存,可使用3天。

  

OasisHLB固相萃取柱或相当者:500mg,6mL。使用前分别用5mL甲醇和10mL水预处理,保持柱体湿润。

  

阴离子交换柱:羧酸型,500mg,3mL。使用前用5mL乙酸乙酯预处理,保持柱体湿润。

  

12.2.2.4 仪器和设备

  

高效液相色谱仪:配有紫外检测器;分析天平:感量0.1mg,0.01g;液体混匀器;固相萃取真空装置;贮液器:50mL;微量注射器:25μL,100μL;刻度样品管:5mL,精度为0.1mL;真空泵:真空度应达到80kPa;离心管:50mL;平底烧瓶:100mL;pH计:测量精度±0.02。

  

12.2.2.5 样品前处理

  

(1) 试样制备

  

对无结晶的实验室样品,将其搅拌均匀。对有结晶的样品,在密闭情况下,置于不超过60℃的水浴中温热,振荡,待样品全部融化后搅匀,迅速冷却至室温。分出0.5kg作为试样。制备好的试样置于样品瓶中,密封,并标明标记。将试样于常温下保存。

  

(2) 提取

  

称取6g试样,精确到0.01g。置于150mL三角瓶中,加入30mL Na2EDTA-Mcllvaine缓冲溶液,于液体混匀器上快速混合1min,使试样完全溶解。样液倒入50mL离心管中,以3000r/min离心5min,待净化。

  

(3) 净化

  

将上清液倒入下接OasisHLB柱或相当者的贮液器中,上清液以≤3mL/min的流速通过Oasis或相当的固相萃取柱,待上清液完全流出后,用5mL甲醇-水洗柱,弃去全部流出液。在65kPa的负压下,减压抽干20min,最后用15mL乙酸乙酯洗脱,收集洗脱液于100mL圆底烧瓶中。

  

按上述方法使洗脱液在减压情况下以≤3mL/min的流速通过阴离子交换柱,待洗脱液全部流出后,用5mL甲醇洗柱,弃去全部流出液。在65kPa负压下,减压抽干5min,再用4mL流动相洗脱,收集洗脱液于5mL样品管中,定容至4mL,供液相色谱仪测定。

  

12.2.2.6 测定

  

(1)液相色谱条件

  

色谱柱:μBondapakC18,10μ,300mm×3.9mm或相当者;流动相:乙腈+甲醇+0.01mol/L草酸溶液(20+10+70,v/v/v);流速:1.5mL/min;柱温:25℃;检测波长:350nm;进样量:100μL。

  

(2)液相色谱测定

  

根据样品溶液中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素含量的情况,选定峰高相近的标准工作溶液,标准工作溶液和样品溶液中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素的响应值均应在仪器测定的线性范围内。对标准工作溶液和样品溶液等体积参差进行测定。在上述色谱条件下,土霉素、四环素、金霉素、强力霉素色谱峰的分离度应大于1.2,其参考保留时间分别是4.0min、4.8min、9.6min、14.0min。土霉素、四环素、金霉素、强力霉素标准物质色谱图见图12-4。

  

  

图12-4 土霉素、四环素、金霉素、强力霉素标准物质色谱图.
4.027min,土霉素:4.757min,四环素;9.578min,金微素:14.015min,强力霉素

  

 

  

 

  

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