11.1.4.2 测定方法

国内外报道用于QNs残留分析的检测方法主要有高效液相色谱法(HPLC)、毛细管电泳测定法(CE)等，也有报道用气相色谱法(GC)、高效薄层色谱法(HPTLC)、液相色谱-质谱联用法(LC-MS)、免疫分析方法(IA)等方法。

(1)高效液相色谱法(high performance liquid chromatography，HPLC)

HPLC是最常用的分离方法，通常使用C18/C8等色谱柱，但有些情况下也引入苯基或氨基键合的固定相。多数方法使用经端基封闭处理的色谱柱甚或高纯硅质柱，防止由于色谱柱填料残留的硅醇基(硅羟基)和金属杂质而导致的色谱峰拖尾。也可以在流动相中加入季铵盐、烷基硫酸钠或烷基磺酸钠等离子对试剂，它们可与质子化的待测物以及三乙胺(TEA)或季铵盐形成离子对，而TFA或季铵盐可与待测物竞争残留的活性硅醇基，能够获得更好的保留、洗脱，和更大程度的分离效果。流动相组成主要是乙腈-水，有时也使用乙腈-甲醇-水、乙腈-四氢呋喃(THF)-水或乙腈-二甲胺-水等，也有报道使用乙腈-甲醇-四氢呋喃-水四元溶剂体系，少数文献报道有使用甲醇-水为流动相。多残留分析常采用梯度洗脱方法，为改善峰形常在流动相中加入扫尾剂，可以减少硅醇基的电离，加入四氢呋喃(THF)，也可以减少拖尾峰。磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、草酸缓冲液等经常用于将流动相控制pH2～4，可以降低其与QNs阳离子之间的相互影响，获得较好的分离。

HPLC常用的检测器包括紫外检测器(ultraviolet detector，UVD)、二极管阵列检测器(diode-array detector，DAD)、荧光检测器(fluorescence detector，FLD)、电化学发光检测器(electrogenerated chemiluminescence detector，ECLD)，以及UVD和FLD联用等。

1)荧光检测器(FLD)

QNs分子的基本结构属于喹啉酮类或氮杂喹啉酮类，具有很好的荧光性，常使用FLD检测器，但不同QNs的荧光光谱又相差较大。在使用荧光检测法进行QNs多残留检测时，可采用程序波长检测法，使每个分析物的检测波长处于其自身波长范围内，提高检测灵敏度和选择性。

Rambla-Alegre等报道了采用HPLC-FLD程序荧光波长检测鸡蛋和牛奶中的DAN、DIF、FLU和MAR的方法。程序荧光检测波长:0～9.3min，λex=260nm，λem=366nm，检测FLU；9.3～20min，λex=280nm，λem=450nm，检测MAR、DAN和DIF。四种QNs的回收率为96%～113.7%，RSD小于10%，LOD和LOQ分别为0.03～1.8μg/kg和0.5～6μg/kg。Herra-Herrera等报道了采用HPLC-FLD检测牛、绵羊和山羊奶中7种碱性QNs(FLE、CIP、LOM、DAN、ENR、SAR和DIF)的方法。样品用三氯乙酸～甲醇提取，HLB固相萃取柱净化，HPLC-FLD检测，激发和发射波长分别为280nm和450nm。研究发现，在流动相中添加1-乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐(1-ethyl-3-methylimidazolium tetrafuoroborate，EMlm-BF4)色谱分离效果要优于添加1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐(1-butyl-3-methylimidazolium tetrafuoroborate)，流动相为含3mmol/L EMIm-BF4和10mmol/L乙酸铵的水溶液(乙酸调pH3.0)-乙腈(87+13，v/v)，在Nova-Pak C18(150mm×3.9mm，4um)色谱柱上分离，18min内良好分离了7种QNs，且没有干扰。在牛奶中QNs的回收率为94%～113%，LOD为0.5～6.8ug/L；在山羊奶中QNs的回收率为79%～～92%，LOD为0.6～7.7ug/L；在绵羊奶中QNs的回收率为73%～87%，LOD为0.6～8.1μg/L。Haritova等建立了HPLC-FLD法检测禽类血清样品中的QNs。反相色谱柱分离，CIP和ENR的激发和发射波长分别设定在277nm和418nm，DIF为295nm和500nm，MAR为338nm和425nm。流动相为乙腈和磷酸盐缓冲液中，流速为1mL/min。标准曲线的线性范围为10～1000ng/mL。ENR不干扰CIP、DIF和MAR的测定，用来作为DIF和MAR检测的内标。批间RSD为1.73%～13.21%，批内RSD为1.11%～7.18%，平均回收率高于85%。Rambla-Alegre等还建立了检测尿液中QNs的HPLC方法。样品无需前处理，直接进样检测。检测CIP、LOM、OFL、LEV和莫西沙星(moxifloxacin)时，以0.15mo/L十二烷基硫酸钠、12.5%丙醇和0.5%三乙胺(pH3.0)为流动相，激发波长为285nm，发射波长为465nm；检测LOM、OFL和moxifloxacin时，以0.05mol/L十二烷基硫酸钠、2.5%丙醇和0.5%三乙胺(pH3.0)为流动相，激发波长为295nm，发射波长为485nm。在5ng/mL、50ng/mL和500ng/mL 3个添加水平，方法回收率为84.3%～116.2%，RSD低于8.4%，5种QNs的LOD低于0.5ng/mL，LOQ为1ng/mL。

李存等建立了同时检测动物肌肉组织中9种QNs(MAR、OFL、LOM、CIP、DAN、ENR、SAR、OXO、FLU)和磺胺类药物的HPLC-FLD检测方法。动物肌肉组织样品用磷酸盐缓冲液提取，HLB固相萃取柱净化，洗脱液氮气吹至近干，磷酸盐缓冲液复溶，采用甲酸水溶液-乙腈体系作为流动相，梯度洗脱，FLD测定。程序荧光检测波长：0～11min，λex=297nm，λem=515nm；11～25min，λex=280nm，λem=450nm；25～55min，λex=320nm，λem=-365nm。方法的线性良好，相关系数(r)大于0.9987；平均回收率为70.6%～103.4%，RSD为1.2%～11.4%；QNs的LOD为0.04～0.4μg/kg。潘媛等建立了HPLC-FLD法检测动物源性食品中6种QNs的方法。鱼、肉及肝脏等样品需经过乙腈-0.1mol/L KH2PO4缓冲液提取，乙腈饱和的正己烷洗涤去除油脂；蛋及乳制品样品用正己烷饱和的乙腈提取，乙腈饱和的正己烷去脂。方法的回收率为82%～105%，RSD为40%～12%，NOR、CIP、SAR及DAN的LOD为5.0μg/kg，ENR、DIF为3.0μg/kg。Stoilova等建立了HPLC-FLD法同时测定6种动物源基质中9种常用QNs。该方法使用乙腈萃取，OasisHLB固相萃取柱净化，以甲酸水溶液、甲醇和乙腈作为流动相，C18色谱柱分离，梯度洗脱，多波长激发/发射荧光检测器分析。9种QNs的LOD和LOQ分别为3～50μg/kg和7.5～100μg/kg。回收率为77%～120%，其RSD小于30%。Takeda等建立了一种有效筛查多种动物和水产品中QNsHPLC-FLD法。目标分析物包括MAR、OFL、NOR、CIP、ENR、DAN、ORB、DIF、SAR、OXA、NAL和FLU。样品包括10种不同的食物产品：肉(牛、猪和鸡)、肝脏(鸡)、生鱼(虾和鲑鱼)、鸡蛋和加工食品(火腿、香肠和鱼香肠)。乙腈-甲醇(1+1，v/v)提取，经带有Fe3+的固相化金属螯合亲和柱净化，以甲醇-水-甲酸(15+85+0.1，v/v)作为流动相，反相色谱柱分离，FLD在不同激发/发射波长下进行检测(OFL、NOR、CIP、ENR、DAN、ORB、DIF和SAR：295nm/455nm；MAR：295nm/495nm；OXA、NAL和FLU：320nm/365nm)，NOR/OFL，ORB/DIF和ENR/DAN不能完全分离。最佳条件下，日内和日间回收率分别为88.5%(56.1%～108.6%)和78.7%(44.1%～99.5%)，RSD分别为7.2%(0.7%～18.4%)和6.8%(1.4%～16.6%)；LOQ为0.8μg/kg(DAN)-6.5μg/kg(SAR)。

2)紫外检测器和二极管阵列检测器(UVD/DAD/PDA)

有些QNs如PIR和MAR的自身荧光较弱，多采用UVD或DAD来测定。Tsai等建立了HPLC-DAD方法检测猪肌肉组织中的SAR、DAN、NAL、OXO、ENR、FLU和哌啶。DLLME提取和净化，流动相为含有3.7mmol/L无水硫酸镁和十二烷基硫酸钠的乙腈-0.05mol/L NaH2PO4 (pH2.5)(35+65，v/v)，在Cosmosil 5C18-AR-II(5um，250mm×4.6mm)色谱柱上分离。方法回收率为93.0%～104.7%，LOD为5.6～23.8μg/kg。Bailac等建立了SPE-LC-UVD方法检测鸡组织中的7种QNs(CIP、DAN、ENR、SAR、DIF、OXO、FLU)。流动相为乙腈-柠檬酸缓冲液(12+88，v/v)，方法比较不同色谱柱的分离效果，包括Kromasil C8柱(4.6mmi.d.×250mm)、Inertsil C8柱(4.6mmi.d.×250mm)、ZorbaxEclipseXDB-C8柱(4.6mmi.d.×150mm)、LichrospherC18柱(4.6mmi.d.×250mm)和Nucleosil C18柱(4.6mmi.d.×250mm)。结果发现，使用C18柱色谱峰会变宽，而C8色谱柱色谱峰会更好，Inertsil C8和ZorbaxEclipseXDB-C8可以使SAR和ENR达到基线分离，ZorbaxEclipse XDB-C8柱分离效果最好。OXO、FLU在250nm检测，其他QNs在280nm检测。方法回收率为58%～107%，LOD为10～30μg/kg。Evaggelopoulou等报道了HPLC-DAD法检测鱼和乌颊鱼中7种QNs。PerfectsilODS-3(250mm×4mm，5um)的色谱柱进行分离，梯度洗脱，流动相为含0.1%三氟乙酸(pH1)的乙腈和甲醇，DAD在255nm下检测酸性QNs(OXO、FLU和NAL)，275nm下检测CIP、DAN、ENR和SAR。

3)紫外检测器串联荧光检测器(UVD-FLD)

在色谱分析中还将UVD和FLD串联使用，可实现荧光性QNs和非荧光性QNs的同步检测。Marazuela等利用UVD和FLD串联检测牛奶中CIP、ENR、MAR、DAN和SAR残留。其中MAR利用UVD在298nm检测，其他QNs使用FLD检测，激发和发射波长分别为280nm和440nm。流动相为25mmol/L正磷酸溶液(NaOH调pH3.0)和乙腈，梯度洗脱，色谱柱为极性封端AQUATM C18柱(4.0mm×3.0mm，5um)。方法回收率为80%～103%，RSD低于6.6%，LOD为0.5～3ng/mL，LOQ为2.4～10ng/mL。

4) 电化学发光检测器(ECLD)

ECLD是对电极施加一定的电压进行电化学反应，电极反应产物之间或电极反应产物与体系中某种组分之间进行化学反应产生发光，通过测量发光光谱强度来测定物质含量的一-种痕量分析方法，具有灵敏度高、选择性好、操作简便、易于控制，并且实验中的一些试剂可重复使用等优点。Yao等在研究氟喹诺酮的电化学发光性质时发现，在中性磷酸盐缓冲溶液中，电位在0～1.8V范围内进行扫描基本没有电化学发光；同样条件下，过硫酸根有较弱的电化学发光；但当氟喹诺酮和过硫酸根同时存在时，同样条件下进行电位扫描可以产生非常强的电化学发光现象，发光强度大概是单独过硫酸根存在时的350倍。Sun等研究发现OFL在NaNO3溶液中可以直接产生电化学发光现象，结合HPLC建立了一种简单灵敏的检测血清中OFL含量的新方法。在最佳实验条件下，OFL检测的线性范围是1.0×10-8～4.0×10-6 g/mL，LOD是4×10-9 g/mL。

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