9.2.4.6测定

(1)液相色谱条件

色谱柱：ZORBAX Eclipse SB-C8，3.5um，150mm×4.6mm(内径)或相当者；柱温：25℃；流动相：乙腈-水(7+3，v/v)；流速：0.5mL/min；进样量：50μL。

(2)质谱条件

离子化方式：电喷雾电离；扫描方式：负离子扫描；检测方式：多反应监测(MRM)；离子源温度：350℃；雾化气压力：0.083MPa；气帘气压力：0.1240MPa；辅助气1压力：0.2756MPa；辅助气2压力：0.2412MPa；喷雾器电流：-5μA；电喷雾电压：-4500V；定性离子对、定量离子对、碰撞能量和去簇电压见表9-20。

表9-20 5种激素及代谢物的定性离子对、定量离子对、碰撞能量和去簇电压

9.2.4.7 分析条件的选择

(1) 被测物的提取

牛奶成分复杂，除水分外还含有蛋白质、脂肪和多种微量元素，样品的提取是实验的关键。参照相关文献考察了叔丁基甲醚、乙腈作为被测物提取剂对样品处理结果的影响。研究表明，采用叔丁基甲醚作为提取溶液，提取中极易发生乳化现象，且回收率偏低。改用乙腈提取后，溶液未出现乳化现象，并且回收率提高。因此本方法采用乙腈作为蛋白沉淀剂和提取剂。

(2) 固相萃取净化

本方法首先选用了OasisHLB柱进行净化，但灵敏度较低，后改用美国Waters公司OasismAX柱(60mg)进行SPE净化处理后，灵敏度及回收率相对较高。本方法检测的5种类雌激素及代谢物要求限量低，基质复杂，因此考虑应用自动固相萃取仪(ASPE)减少人为因素误差，提高重现性。对淋洗液比例、洗脱液比例、洗脱液用量各项参数进行优化，结果见表9-21至表9-23。

表9-21 淋洗液比例对回收率的影响(淋洗液用量2mL)

表9-22 洗脱液比例对回收率的影响(先用1mL氨水-水[5+95]淋洗，0.5mL甲醇淋洗，再进行洗脱)

表9-23 洗脱液用量对回收率的影响(分三次洗脱，每次用量3mL)

实验检测的目标物为两类，玉米赤霉醇及代谢物和二苯乙烯类激素。两类物质性质上存在差别，因而在确定最终实验条件时需兼顾两类物质。由表9-21可见，淋洗液比例选用氨水-水(5+95，v/v)，2mL，被测物基本.上没有丢失。由表9-22实验结果得出，应用甲酸-甲醇(5+95，v/v)洗脱液可得到全部目标物较高的回收率。由表9-23实验结果得出，应用6mL洗脱液能将待测物洗脱约90%，再增加洗脱液用量回收率没有明显提高，但吹干时间将延长。最终确定了本实验淋洗液比例、洗脱液比例、洗脱液用量各项参数。

(3)质谱条件的优化

采用注射泵直接进样方式，以5μL/min将玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、己烯雌酚、己烷雌酚和双烯雌酚的标准溶液分别注入串联质谱的离子源中。-级质谱分析(Q1，母离子扫描)比较了电喷雾电离(ESI)的正方式和负方式，5种被测物均在负方式条件下得到了较高的响应值，确定了准分子离子峰[M-1]，优化了去簇电压(DP)。对被测物的准分子离子碰撞后，进行二级质谱分析(MS2，子离子扫描)，得到子离子质谱图，见图9-3。对每种被测物选定的子离子进行碰撞气能量(CE)的优化。在连接了液相色谱仪后，采用电喷雾电离(ESI)负方式进行测定。通过对ESI(-)条件下离子源温度、雾化气压力、气帘气压力、辅助气1压力、辅助气2压力、喷雾器电流等参数优化，确定了本方法最终分析参数。以优化后本方法提供的参数对被测物进行检测，玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、己烷雌酚、己烯雌酚和双烯雌酚的方法检出限为1.0μg/kg。

(4)HPLC条件的优化

本方法先后试用了Waters公司、Agilent公司、Merck公司等多个品牌的C18和C8柱，经比较Agilent公司的ZORBAX SB C8(150mm×4.6mm，3.5μm)对玉米赤霉醇和二苯乙烯类激素的分析柱效更好一些。采用ESI电离时，乙腈作为流动相，流速0.5mL/min。在此前提下试验了不同流动相比例和梯度程序。由于流速较高，乙腈比例不宜低，最终选定乙腈-水=70+30。对比了不同梯度洗脱程序的分离结果，没有明显改善，因而选定了固定比例流动相。