(3)高效液相色谱法(high performance liquid chromatography，HPLC)

HPLC是20世纪70年代发展起来的一种高效、快速的分离分析技术，可同时测定多种激素残留。与GC相比较，HPLC不受样品挥发性和热稳定性的限制，特别适合于高沸点、大分子、强极性和热稳定性差的化合物的分离分析，缺点是检测灵敏度稍差，溶剂消耗量大，且很多溶剂对人体健康有一定的损害。主要采用的检测:器有紫外检测器(ultraviolet detector，UVD)/二极管阵列检测器(diode-array detector，DAD)和荧光检测器(Fluorescence Detector，FLD)。

1)UVD/DAD检测

郁倩建立了畜禽肉中同时检测雌三醇、雌二醇、炔雌醇和雌酮等4种ASs的HPLC方法。色谱分离采用Eclipse XDB C18(4.6mm×150mm，5μm)色谱柱，流动相为乙腈和水，梯度洗脱，流速1.0mL/min，DAD在210nm检测。4种雌激素分离效果良好，标准曲线相关系数r大于0.9993，方法LOD为3.9～4.9ng/g，，回收率为68%～106%，RSD小于6%。Liu等建立了猪肉中醋酸群勃龙、β-群勃龙的HPLC分析方法。样品用水和乙酸乙酯匀质，振荡分层后，有机相用无水Na2SO4干燥，再经硅胶柱净化后，HPLC-UVD检测。采用Capcellpak C18色谱柱(250mm×4.6mmi.d，5μm)分离，甲醇-水(70+30，v/v)等度洗脱，流速1.0mL/min，检测波长为340nm。醋酸群勃龙、β-群勃龙的LOD分别为0.12μg/kg和0.22μg/kg，LOQ分别为0.37μg/kg和0.66μg/kg，RSD小于等于13.25%。邹琴建立了罗非鱼中甲基睾酮残留测定的HPLC方法。样品经乙醚超声提取，石油醚净化，以ODS-C18柱分离，77%甲醇溶液为流动相，流速1.0mL/min，UVD检测波长为254nm，外标法定量。该方法在40～10000μg/L(μg/kg)范围内线性关系良好，LOD在3～27μg/L(μg/kg)范围内，LOQ在8～80μg/L(μg/kg)范围内；平均加标回收率在75.9%～94.1%之间，CV在1.31%～6.63%之间。

吴启陆等对鸡蛋中雌二醇、雌酮、雌三醇和睾酮等4种ASs的残留检测方法进行了研究。用甲醇提取，上清液用0.22um微孔滤膜过滤后，HPLC-UVD检测。色谱柱为ZORBAX EcLipse XDB-C18柱，流动相为乙腈-甲醇-四氢呋喃-0.01moL/L醋酸钠溶液(20+20+10+50，v/v)，等度洗脱，流速1.0mL/min，检测波长为270nm。方法LOD为0.01μg/mL，平均回收率为75.8%～104.3%。

Koole等报道了牛尿中ASs的HPLC多残留检测方法。采用HypersilOODS(150mm×4.6mmi.d，5μm)分析柱，乙腈和水为流动相，梯度洗脱，DAD在190～400nm范围检测。雄激素的LOD为0.5～5ng，雌激素为5～10ng。

2)FLD检测

Dong等建立了检测鱼和虾中雌二醇、雌三醇、4-羟雌甾二醇和2-甲氧基雌二醇的HPLC-FLD方法。样品经乙腈提取，MSPD净化，HPLC-FLD测定。分析柱为vp-ODS-C18柱，流动相为甲醇-水(65+35，v/v)溶液，流速1.0mL/min，激发波长为280nm，发射波长为310nm。除4-羟雌甾二醇为60%外，其他3种雌激素的回收率均大于80%，仪器精密度小于8%，方法精密度小于13%，LOD为0.02～0.44μg/mL，LOQ为0.06～1.34μg/mL，可用于水产样品中雌激素定量分析研究。