8.1.4.2 测定方法

有关动物源基质中ASs残留检测方法的报道很多，主要是免疫分析法和色谱分析法。免疫分析法主要有酶联免疫测定法(ELISA)、放射免疫测定法(RIA)和胶体金免疫试纸法(GICA)；色谱分析法主要有气相色谱法(GC)、气质联用法(GC-MS)、高效液相色谱法(HPLC)和液质联用法(LC-MS)。长期以来，GC-MS和ELISA一直是ASs残留分析的主要手段；但近年来，HPLC和LC-MS的应用越来越多，新的筛查技术(如分子生物学检测方法)也开始有研究报道。

(1) 气相色谱法(gaschromatography，GC)

GC以气体为流动相，用于残留药物的检测，具有高效能、高选择性、高灵敏度、分析速度快和应用范围广等特点。对于ASs残留分析，较早之前有过相关报道，但已逐渐被GC-MS方法取代。李青等建立了GC-ECD测定畜禽肉及内脏中雌二醇残留量的方法。采用乙醚和石油醚提取，旋转蒸干后，石油醚溶解残渣，甲醇-水(4+1，v/v)LLP净化，在吹干的试样残渣中加入1mL HFBA，超声20min，再用氮气吹干，加入0.5mL异辛烷，混匀后GC-ECD检测。色谱柱为SE-54，载气为氦气，进样口温度为290℃，检测器温度为300℃。方法LOD为0.5μg/kg，回收率为84.0%～93.0%。

(2)气相色谱-质谱联用法(gaschromatography-massspectrometry，GC-MS)GC-MS法是目前ASs残留检测中采用较多的方法。在各国颁布的标准方法中，GC-MS通常作为其最后的确证方法。ASs可以采用电子电离(EI)和化学电离(CI)的方式检测。

1)电子电离(EI)

Fritsche等建立了牛肌肉组织中雄激素、雌激素的GC-MS检测方法。极性ASs通过甲醇-水混合液提取后，用C18 SPE柱净化，而非极性ASs则需要氨基柱进一步净化，最后混合后用MSTFA-TMIS-DTE(1000+2+2，v/v)硅烷化衍生，GC-MS测定。分析柱为DB-5 mS毛细管柱，载气为氮气，进样口温度260℃，质谱接口温度290℃，EI源，电子能量为70eV，离子源温度为180℃。该方法LOD为0.02～0.1μg/kg，C19和C21甾类激素的添加回收率分别为56%～79%和54%～114%。Seo等用GC-MS同时测定了鸡肉中的雌二醇、睾酮等多种激素。样品经甲醇-水超声波提取，冷冻后过滤除脂，C18 SPE柱净化后，GC-MS测定。DB-1mS柱分离，载气为氦气，进样口温度为250℃，质谱接口温度为280℃，EI-SIM模式检测。方法LOD可达0.1～0.4μg/kg，合成和天然生长激素的总体回收率为68%～106%。Marchand等利用GC-MS检测肉中的23种ASs。通过LLP将ASs分为两类：含D4-3-酮类和酚结构类。两类化合物分别在60℃和室温，分别用MSTFA-TMIS-DTT和MSTFA-I2进行衍生，再用GC-MS测定。酚结构药物用MN-δ3柱分离，D4-3-酮类药物用OV-1柱分离，进样口温度为250℃。该方法的LOD为5～100ng/kg。陈捷等建立了不同动物肌肉组织中ASs残留的GC-MS检测方法。样品经组织捣碎、用β-葡糖苷酸酶/芳基硫酸酯酶溶液酶解和超声提取后，用叔丁基甲醚萃取，再进行反相SPE净化，衍生化后进行GC-MS测定。采用DB-1毛细管柱分离，载气为He，不分流进样，进样口温度280℃，接口温度280℃，EI源，溶剂延迟10min。该方法LOD可达1.0～2.0μg/kg；在2.0μg/kg添加水平上，平均回收率可达62.5%～80.5%，RSD为12.5%～26.8%

Kootstra等建立了尿液中ASs多残留检测的GC-MS方法。采用了两种不同的衍生化试剂：HFBA和TMS，主要用于定性和半定量分析低剂量的ASs。质谱条件为：He为载气，FactorFourVF-17MS色谱柱分离，EI离子源，SIM模式检测，质谱源温度为250℃，四极杆温度为120℃，进样口温度分别为260℃(HFBA衍生化产物)和250℃(TMS衍生化产物)。该方法在添加浓度为1μg/L时，测得ASs的CCa为0.06～0.77μg/L，CCβ为0.09～0.46ug/L；添加浓度为2μg/L时，测得ASs的CCa为0.26～0.54μg/L，CCβ为0.44～0.92μg/L。

图8-4 19-去甲雄酮羰基衍生化反应及其产物

图8-5 19-去甲雄酮羟基衍生化反应及其产物

Yamada等报道了采用GC-MS/MS同时检测马尿中蛋白同化类固醇主要代谢物的方法。尿液经β-葡萄糖醛酸酶水解后，用Sep-Pak C18 PlusSPE柱净化，再经叠氮基三甲基硅烷衍生化后，GC-MS/MS离子源为EI源，在MRM模式下检测。该方法的LOD为5～50ng/mL，平均回收率和CV分别为71.3%～104.8%、1.1%～9.5%。Gaillard等采用GC-MS/MS方法检测了人头发中的ASs。采用甲醇提取，碱性水解后，再用乙酸乙酯提取，用氨基柱和硅胶柱进行SPE净化，MSTFA衍生化反应后，GC-MS/MS分析。CPSIL 8 CB色谱柱分离，载气为氦气，脉冲不分流进样，质谱接口温度为300℃，离子源温度为160℃，四极杆温度为70℃，初始炉温为80℃；EI电离，碰撞气为Ar。方法LOD小于等于6.2ng/g，平均添加回收率在61%～94%之间，日内CV小于15.2%。Rambaud等建立了人头发中ASs多残留检测方法。△4-3酮类化合物用MSTFA-TMIS-DTE(1000+5+5，v/v/w)衍生，群勃龙用MSTFA-I2衍生化，苯酚类固醇用MSTFA衍生后，GC-MS/MS分析。用0V-1毛细管柱分离，载气为He，脉冲不分流进样，质谱接口温度为320℃，碰撞气为Ar，EI电离后采用SRM模式分析。方法LOQ可达0.1～10μg/kg，平均回收率为50%。

Impens等建立了牛尿中ASs多残留的气相色谱-离子阱质谱(GC-MSn)检测方法。采用非极性BPX-5柱(25m×0.22mm，ID 0.25um)分离，氦气作为载气，程序升温，进样口温度为250℃，分流室气流速度为60mL/min，采取无分流进样模式；离子源温度200℃，传输线温度275℃，EI电离，离子化能量为70eV。当GC-Ms2分析时，测得17种ASs的CCβ为1～10μg/L；GC-MS3分析时，测得CCβ为2～10μg/L，可用于ASs常规检测。

2)化学电离(CI)

我国国家标准GB/T22967-2008采用GC-负化学电离源(NCI)-MS检测牛奶和奶粉中β-雌二醇残留量。样品经过β-葡糖苷酸酶和芳基硫酸苷酶水解和HLBSPE柱净化后，用五氟苯甲酰氯衍生化(60℃放置15min)，再用GC-NCI-MS在SIM模式下测定，色谱柱为HP-5MS(30m×0.25mm，0.25um)，载气为氦气，梯度洗脱，流速1.0mL/min，选择离子监测，进样量1μL，D4-B-雌二醇为内标定量。牛奶的LOD为0.25μg/kg，奶粉的LOD为2μg/kg。GB/T20749-2006采用类似的方法测定了牛尿中的β-雌二醇。

动物源基质中ASs的部分GC-MS残留检测方法见表8-5。

表8-5 动物源基质中ASs的部分GC-MS残留检测方法

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