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牛肝和牛肉中睾酮、表睾酮、孕酮残留量测定分析条件的选择

[db:作者] / 2022-12-13 00:00

8.2.1.7 分析条件的选择

  

(1) 净化富集条件的选择

  

1) 样品提取方法的选择

  

动物组织中的甾体类同化激素会形成葡糖苷酸轭合物,样品提取时需加入β-葡糖酶/硫酸酶水解后再行提取。甾体类同化激素属脂溶性物质,在极性有机溶剂中溶解度较大,利用其在不同有机溶剂中的溶解度差异,可去除部分干扰物,因此选用甲醇-叔丁基甲醚体系提取。

  

2)净化条件的选择

  

甾体类同化激素在动物体内残留水平低,内源性干扰物质较多,仅通过单纯的液液萃取或简单的固相萃取净化很难达到理想的净化效果,试验中采用极性较低的C18 SPE柱去除极性较大的干扰杂质,继而再用极性较大的硅胶SPE小柱去除极性较弱的干扰物,从试验结果来看这种采用二种极性相反的固相萃取材料进行样品净化、富集的方法可有效地去除样品基体带来的干扰物。与加拿大食品检验局方法相比,采用这种双极性固相萃取净化方式也减少了多次液液萃取的繁琐,缩短了提取时间,提高了工作效率。

  

(2)液相色谱条件的选择

  

液相色谱与质谱联用时由于质谱离子源对液相色谱的流动相成分有一定的限制,为保证获得最大限度的离子化效率,流动相选用了乙腈-甲酸胺体系。动物组织成分复杂,在现有分析条件下,对本方法所测定的三种激素仍存在一定的干扰,且睾酮与表睾酮化学结构相近,若采用等度洗脱难以获得理想的分离效果,经试验采用乙腈-甲酸铵梯度洗脱方式,实现了睾酮与表睾酮的有效分离,也最大限度地减少了样品基质对测定的干扰。

  

(3)质谱条件的选择

  

用蠕动泵以10uL/min的流速分别连续注射1mg/L的三种类固醇激素和二种同位素内标标准溶液入质谱,对五个待测物质进行一级质谱分析(Q1扫描),得到分子离子峰(M+1)+,优化喷雾气(NEB)、气帘气(CUR)、辅助加热气等气路参数,优化各待测定组分分子离子峰的去簇电压(DP),聚焦电压(FP),入口电压(EP),对分子离子峰(M+1)进行二级质谱分析(子离子扫描),得到睾酮、表睾酮、孕酮、氘代睾酮(d5-睾酮)、氘代孕酮(d9-孕酮)的二级质谱。选择强度较高、干扰少的离子对作为监测离子对。采用MRM模式采集数据,选择驻留时间为200ms,优化各离子对的碰撞能量(CE),碰撞池出口电压(CXP)。

  

在定量方式上采用了二种稳定性同位素内标,以氘代睾酮(d5-睾酮)为翠酮、表睾酮的定量参照物,以氘代孕酮(d9-孕酮)作为孕酮的定量参照物,减少了样品处理过程及质谱离子化过程给待测物质带来的定量误差,大大提高定量的准确性。

  

8.2.1.8 线性范围和测定低限

  

用甲醇-水配制浓度睾酮、表睾酮浓度均为0、0.25μg/L、0.5μg/L、1.0μg/L、2.5μg/L,孕酮浓度为0、1.25μg/L、2.5μg/L、5.0μg/L、12.5μg/L的混合标准工作液,每毫升该混合标准工作溶液分别含有5ng氘代睾酮(d5-睾酮)和氘代孕酮(d9-孕酮)。在选定的色谱和质谱条件下进行测定,以标准工作溶液被测组分峰面积与标准工作溶液内标物峰面积的比值对标准溶工作液被测组分浓度与标准工作溶液内标物浓度的比值作线性回归曲线。其线性方程、相关系数见表8-9。

  

表8-9 睾酮、表睾酮、孕酮的定量离子对、线性方程、相关系数

  

  

综合考虑各待测组分的质谱信号信噪比及检测工作的实际需要,确定动物组织(肌肉)中的睾酮、表睾酮的测定低限(LOQ)为0.10μg/kg,孕酮的测定低限(LOQ)为0.5μg/kg,动物组织(肝)中的睾酮、表睾酮和孕酮的测定低限(LOQ)均为0.5μg/kg。

  

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