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β-内酰胺类药物的残留检测(四)

[db:作者] / 2022-12-09 00:00

(7)免疫分析法(immunoassay,IA)

  

IA是以抗原与抗体的特异性、可逆性结合反应为基础的分析技术,具有单独一种理化分析技术难以达到的选择性和灵敏度,非常适用于复杂基质中痕量组分的分离或检测。与常规理化分析技术相比,IA法具有特异性强、灵敏度高、方便快捷、成本低、安全可靠等优点,成为临床、生物医药、环境化学以及兽药残留分析中一种有力的分析手段。目前用于β-内酰胺类药物残留分析的IA方法主要有放射免疫测定法(RIA) 和酶联免疫吸附法(ELISA)。

  

1)放射免疫分析法(radioimmunoassay, RIA)

  

RIA利用放射性物质作为抗体的偶联物,通过同位素标记来检测抗原抗体。该方法的基本原理是微生物细胞表面存在着能与各种β-内酰胺类抗生素共有功能基团相结合的特异性位点,能与各种β-内酰胺类抗生素发生相应的微生物受体反应。检测β-内酰胺类药物残留时,RIA方法使用了两种试剂:经过14C标记的青霉素G和微生物受体结合物(微生物细胞上的特异性受体)。检测时,先加入微生物受体结合物并进行温浴。当检测的样品存在β-内酰胺类兽药残留时,样品中残留的β-内酰胺类兽药立即与微生物受体结合物的相关位点相结合,使得后来加入反应的14C标记的青霉素G无法结合到这些位点上。最后通过检测结合到微生物受体上的14C 标记的青霉素G数量来判断样品中的兽药残留量。张佳利用RIA 建立了快速筛检动物组织中β-内酰胺类药物残留的方法。称取均质好的试样,加入MSU萃取缓冲液,涡旋振荡后80℃孵育30 min,然后置冰水内10 min,离心后吸取上清液。取出组织中的β-内酰胺类药物Charm II 检测试剂盒,加入样品测试液(M2缓冲液),加入闪烁液后读取14C的cpm值。分别添加青霉素G钾25 μg/kg、氨苄西林50 μg/kg、阿莫西林50 μg/kg、邻氯青霉素300 μg/kg、双氯青霉素200 μg/kg、头孢噻呋150 μg/kg于样品中,该方法测得其结果全部为阳性。

  

2)酶联免疫吸咐法( enzyme linked immunosorbent assays, ELISA)

  

ELISA法使用酶进行标记,避免了同位素标记的放射性污染和标记物的稳定性问题,操作方便、仪器简单。同时,ELISA法分析速度快,能同时筛选大量的样品,是批量样品快速筛选的理想检测方法,但也有假阳性高、不能准确定量的缺点,需要配合色谱类仪器进行分析。陆彦等通过碳化二亚胺法(EDC)将氨苄西林上的羧基与血蓝蛋白(KLH)偶联,免疫小鼠制备抗氨苄西林的单克隆抗体,与其他同类药物的交叉反应很低。以此建立的间接竞争ELISA 法检测牛奶中氨苄西林,LOD为0.4 ng/ml。Xie等等利用戊二醛法以头孢氨苄为半抗原制备多抗,建立间接竞争ELISA方法。结果显示,头孢氨苄和头孢羟氨苄的IC50为1.5 ng/mL, LOD均为0.5 ng/mL,交叉反应率为:头孢羟氨苄96%、头孢噻呋36.6%、头孢匹林40.6%、头孢唑啉46.5%、头孢噻肟30.2%、头孢噻吩33.1%。Samsonova等采用间接ELISA法测定牛奶中的氨苄青霉素,该抗体与其他几种PENs交叉反应率小于17%,LOD为5.0 ng/mL。Strasser等采用戊二醛法以氨苄西林为半抗原,合成免疫抗原,制备对多种PENs有较好交叉反应的多抗及单抗,并建立直接竞争ELISA 法。该方法测得氨苄西林的LOD为0.5~1 ng/mL,利用该抗体测得人工污染青霉素G的回收率为89%~97%。

  

(8)表面等离子体共振技术(surface plasmon resonance,SPR)

  

SPR是一种测量界面结构的高灵敏度的光学反射技术。它已成为生物传感、生物医学、生物化学、生物制药等领域的结合现象的标准测量技术。表面等离子体是-种存在电介质常量相反的两种介质界面的电荷密度震荡行为。这种电荷密度波与金属绝缘体界面处存在的边界TM极化电磁波有关。这种波的电场在界面处最大并瞬逝在两种介质中。任何折射率的变化或结合事件都会带来SPR共振的变化。目前,一种以SPR为基础的生物传感器检测技术已经用于β-内酰胺类药物残留分析。Dillon等使用SPR免疫传感器检测牛奶中头孢氨苄残留。首先将头孢氨苄、BSA连接到传感膜表面的葡聚糖凝胶上,然后通过微射流取样操作系统将待测样品连续注射通过传感膜表面,抗原抗体特异性结合后,传感膜表面复合物浓度发生变化,再利用SPR检测器把抗原抗体反应的情况实时反应在传感图上。该方法检测范围在0.24~3.91μg/mL之间。

  

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